人体生物安全问题存在已久,只是对生物污染造成人体 危害问题的深刻认识还是近几十年的事, 近 30年来对世界 范围内的医院感染、实验室感染和动物饲养管理中造成的工 作人员的感染受到广泛重视, 它们是影响生物安全的主要的 直接原因。在传染微生物的各种实验中, 污染环境、实验人 员受染的事故时有发生 。实验室感染的致病因子众多(表 1) ,而微生物实验室通常是可以致使室内或附近人员发生这 种特殊传染疾病的危险场所。因此实验室安全防护已构成 了开展致病微生物研究的基本条件 ,特别是开展传染性大、 毒性强、难以防治和尚无安全认识的新病原体的研究,其中 也包括某些基因工程微生物研究工作的先决条件。所以近 年来世界卫生组织(WHO)和各国卫生部门根据微生物种 类、传染性、实验内容和操作方式要求其必须在相应级别的 实验室内进行。 生物安全实验室 ,特别是高等级生物安全实验室,研究 对象都是对个人和环境有高度危险性的致病微生物,如何避免其对环境的影响, 成为各国政府、环境保护和相关科研人 员高度关注的一个问题。本文将重点阐述三级生物实验室 (BSL -3实验室) 对环境危害的重要因素和防范对策。 

1　BSL 3实验室对环境潜在危害的影响因素 在实验室病原微生物研究过程中, 由于种种原因, 实验 室获得性感染事故时有发生。据有关资料报道, 截止至 1976年,全世界累计获得性感染病例已达 3 921例, 常见的 是由布鲁菌、伤寒沙门菌、土拉热弗朗西丝菌、结核分枝杆 菌、各型肺炎病毒、脑炎病毒引起的感染, 少数还引起第二代 感染[ 1] 。

BS L -3实验室主要是进行三级危险度病原微生物和高 浓度或大量的二级危险度病原微生物的分离培养、诊断、鉴 定、研究等相关工作的,上述病原微生物都属于这一范畴。

实验室感染的途径一般有黏膜接触感染、食入感染、吸 入感染和接触感染动物感染。在实验室日常工作中, 对实验 室感染性固体废弃物和感染性液体废弃物的处理应高度重 视,通常用物理消毒的方法进行消毒处理, 例如用高压灭菌 的方法对其进行消毒处理,或者将化学消毒和物理消毒方法 结合在一起使用。对感染性病原微生物气溶胶的吸入感染 重视程度往往不够,也导致了污染空气是造成实验室相关感 染的主要因素。 Ke n ny等 [ 2] 曾用安德森空气微生物采样器 测定了一些实验室操作中产生气溶胶颗粒的大小, 结果发 现,搅拌粉碎器产生的气溶胶颗粒中, 直径小于 5 μm的占 98%; 相反,冻干培养物产生的气溶胶颗粒, 直径大于 5 μm 的占 80%。其他如收取鸡胚培养液、吸管吹吸搅拌样品、离 心、超声波粉碎、跌碎菌液瓶等所产生的气溶胶颗粒, 平均直 径小于 5μm的较多。 We d u m等[ 3]报道,暴露于炭疽菌芽孢 气溶胶的动物,在整个饲养期间( 13 d) , 在其笼子周围空气 中都可找到炭疽菌芽孢; 感染猴的粪便、唾液中可带菌 4 d 。 将豚鼠暴露于枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢气溶胶以后, 可连 续产生该菌气溶胶长达 21 d之久。不同的病原微生物在空 气中的存活能力也不相同, 但病原微生物形成气溶胶后, 都 可以提高呼吸道吸入导致感染的发生。 对存活力强的病原 微生物可能会随着空气播散而传播到较远的地方, 并引起疾 病的流行。如能够引起人兽共患病的土拉热弗朗西丝菌就 可以经呼吸道感染。该菌在气溶胶状态下存活率较高, 经常 发生实验室感染。 Ba r be i t o等[ 4]报道, 在该单位实验室走廊 内,因打碎一批土拉热弗朗西丝菌平板产生的气溶胶, 使在 场的 14人中的 5人感染, 其中 1人距离事故地点远达 20 m 以上。由此可见,在生物安全实验室试验过程中产生的感染 性“三废(固废、液废和气废) ”中,对人员感染和环境危害程 度最大的是污染的空气。 总之,在实验室中微生物气溶胶的产生大多无法察觉, 人们往往放松警惕, 而在不知不觉中受到感染。 因此, 应将 防止气溶胶的产生和防止已经产生气溶胶的进一步扩散作 为实验室感染预防的首要措施。 2　防止 BS L3实验室对环境危害的基本要素 三级生物安全实验室在英文中有 3种表述方式: 一种是 p hy s i c a lp r o t e c t i o nt hr e el a b o r a t o r y , 即三级物理防护实验室, 又称 P 3实验室; 二是 c o nt a i nme n tl e v e lt h r e el a b o r a t o r y , 即防 护等级三级实验室; 三是 b i o s a f e t yl e v e lt h r e el a b o r a t o r y , 即生 物安全三级实验室,又称 BS L -3实验室。这 3种表述方式其 内在的含义都是提高物理防护能力, 将病原微生物的操作局 限在能防止传染材料特别是防止气溶胶扩散到实验室外环 境中。为了保证病原微生物实验室在试验操作过程中产生 的病原微生物气溶胶不扩散到实验室外环境, 要求排出实验 室的空气中病原微生物达到“零排放 ”。 BS L -3实验室 “零排 放”的含义是, BSL -3实验室在试验活动过程中产生的感染 性三废( 固体、液体和气体) 在排出实验室之前, 经过高压灭 菌或化学消毒加高压灭菌以及高效空气粒子过滤器过滤后, 对三废用生物学培养法进行培养, 没有活的病原微生物生 长,即为零排放。

2. 1　BSL -3实验室设施的建设 目前, 在全世界范围内, BSL -3实验室是高等级生物安 全实验室中数量最多、使用频率最高的一类实验室。因此, BS L -3实验室的设施建设能否达到保护环境的要求, 最重要 的特征是对实验室内污染空气的处理。在 WHO2004年出 版的第 3版《实验室生物安全手册》、加拿大 2004年出版的 第 3版《实验室生物安全指南》以及美国 1999年出版的第 4 版《微生物和生物医学实验室生物安全指南》中, 对 BS L -3 实验室防止污染空气泄漏到外环境的措施都有严格的要求。 我国 2004年 5月颁布的中华人民共和国国家标准《实验室 生物安全通用要求 》GB 19489-2004( 2004 年 10月 1日实 施) 、建设部 2004年颁布的 《生物安全实验室建筑技术规 范》GB50346-2004( 2004年 9月 1日实施) 、2002年卫生部颁 布中华人民共和国行业标准 《微生物和生物医学实验室生 物安全通用准则》WS 233-2002( 2003年 8月 1日实施 ) 等, 对 BS L -3实验室防止污染空气泄漏进入外环境的措施都作了 明确的要求。 BS L -3实验室的结构宜采用“盒子中的盒子”的原理, 即 围场隔离技术, 主要有两大类: 机械密封隔离分区和负压通 风过滤隔离技术。 

2. 1. 1　机械密封隔离分区　用密闭的围墙把实验室与公共 的外环境隔离开, BSL -3实验室由外向里可以划分为清洁区 (一更、二更、淋浴) 、Ⅰ缓冲区、半污染区 ( 准备间 ) 、Ⅱ缓冲 区和污染区(试验操作区)5个区域, 污染区设在最里面, 非 污染区设在周围, 半污染区置于中间。 Ⅰ缓冲区连接清洁区 和半污染区, Ⅱ缓冲区连接半污染区和污染区, 缓冲区是由 两扇互锁门构成的, 即只有一扇门关闭时,另一扇门才能开 启。此种系统的作用能够限制室内空气的流通,再加上负压 通风, 保证气流方向永远是从非污染区流向半污染区。 污染 区内污染的空气不会向外扩散[ 5 , 6] 。 

2. 1. 2　负压通风过滤隔离技术　用控制气流速度和方向控 制某一个小空间的空气不能自由与其他空间交换,只能通过 高效过滤器过滤排放 。 在 BS L -3实验室通风系统设计中, 要求各区室内的空气 压力保持一定的压力梯度, 使空气只能由清洁区流向污染 区, 呈单向流动。例如,与大气压相比非污染区压差为零, 半 污染区为 -20 Pa ,污染区是 -40 Pa [ 6] 。这样就能保证气流 向污染区流动, 经过高效过滤器过滤排放以保证安全。 送风 排风的程序上要求: 开机时先排后送, 在停机时,先停送风后 停排风。 许多实验室操作都能产生粒径 <10 μm的微生物气溶 胶, 这些微小粒子能够长时间地悬浮在空气中, 当它们被人 吸入至呼吸道就有一部分或大部分沉着在呼吸道的表面, 在 那里繁殖扩散, 进入体内的各个器官或组织, 进一步繁殖, 致 使人体发生感染。因此, 污染区内试验操作产生的病原微生 物气溶胶是不可自由扩散的, 或者说不能让这种被污染的空 气被人体吸入, 也不能进入大气。为此, BS L -3实验室污染 区和半污染区的空气一律要经过高效空气粒子过滤器过滤 后才能排放。 高效空气粒子过滤器对 0. 5 μm的粒子滤除率达到99. 97%,对 0. 3 μm的粒子滤除率达到 99. 99%[ 7] 。高效空 气粒子过滤器安装位置很重要,原则是尽量降低空气污染的 范围,就是说尽可能靠近产生污染的地方安装。 按照国标 GB 19489-2004的要求,从 BS L -3实验室顶部送风, 从下面排 风,且送风口和排风口呈对角发布。 应特别重视的一点是, BSL -3实验室排风口的高效空气粒子过滤器应安装在排风 口的最前端,使污染区和半污染区内的空气没有出房间就已 经净化了。现在,国内的少数 BS L -3实验室排风口的高效空 气粒子过滤器安装在排风管道的末端或者安装在远离排风 口的风机前端,这样非常容易造成排风管道的污染, 且管道 内消毒很困难,容易在更换高效空气粒子过滤器时造成人员 感染和环境污染。 BSL -3实验室污染空气排出时的净化流程为: 空气※前 端高效空气粒子过滤器过滤※末端高效空气粒子过滤器过 滤※外环境; BLS -3实验室内的污染空气※生物安全柜高效 空气粒子过滤器过滤※进入排放管道 ※高效空气粒子过滤 器过滤※外环境。 

2. 2　BSL -3实验室安全设备的要求 BSL -3实验室中的安全设备主要包括高压灭菌器、紫外 线消毒设备、生物安全柜和个人防护装备等。安全实验室内 所有的污染物均需消毒灭菌后才能传出,其中包括废物、废 液和使用过的器材、物品以及实验动物尸体都要进行消毒或 灭菌处理。而能够产生微生物气溶胶的试验操作应在生物 安全柜中进行,将产生的微生物气溶胶限制在一个很小的空 间范围内,将操作人员与污染空气隔离开, 并能够防止其扩 散,通过高效空气粒子过滤器过滤后进入排风管道排出实验 室。 

2. 2. 1　消毒灭菌设备 高压灭菌器是 BS L -3实验室中最为 重要的一种消毒设备,它能够把所有具有感染性的固体废弃 物和液体废弃物彻底灭菌。要求 BS L -3实验室中的高压灭 菌器是双开门、双门互锁 ,排出的蒸汽自动回收再消毒, 灭菌 最高温度 144℃, 最好是自动控制和记录。 BSL -3高压灭菌 器安装在清洁区和半污染区之间。 紫外线消毒多用于室内包括传递窗和生物安全柜的表 面和空气消毒,它可以是固定的, 也可是移动式的。 紫外线 消毒方便实用,但不能彻底灭菌, 特别对细菌的芽孢杀灭效 果很差[ 8] 。气溶胶消毒法是利用各种化学消毒药物的喷雾 形成消毒剂气溶胶对空气和表面进行消毒的一种方法, 具有 良好效果,如过氧乙酸喷雾消毒。经实践证明, 在对细菌芽 孢污染的表面消毒时,只需每立方米喷雾 2%的过氧乙酸溶 液 8ml , 作用 30 mi n( 18℃以上的室 温下) , 灭菌率可达 99. 90%。但过氧乙酸的腐蚀性很强 ,使用时应注意[ 9] 。 另外,对固体和液体废弃物的化学消毒, 应严格按照国 家有关消毒技术规范进行,特别应注意化学消毒剂有效消毒 成分的浓度和消毒时间。 目前,国内 BS L -3实验室对感染性液体和固体的处理一 般采用化学消毒罐和物理消毒罐联合消毒, 各两套, 一套应 用,另一套备用。先进行化学消毒, 一般浸泡 24 h以上; 再 进行物理消毒,采用高压蒸汽灭菌。这种化学物理联合消毒 方法非常有效,但化学消毒剂的有效浓度和消毒时间必须充 分保证,最好每月进行一次生物指标的监测。

2. 2. 2　生物安全柜 生物安全柜是一种负压箱式结构的安 全设备, 设计用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材 料避免接触在操作原始培养物 、菌毒株以及诊断标本等具有 传染性的实验材料时可能产生的传染性气溶胶和溅出物。 当对液体或半流体进行操作时, 例如摇动、倾倒、搅拌,或将 液体滴加到固体表面上或另一种液体内时,均有可能产生气 溶胶。在对琼脂板划线、用吸管接种细胞培养瓶、采用多道 加样器将传染性试剂的混悬液转移到微量培养板中、对传染 性材料进行涡旋匀质化、对传染性液体进行离心以及进行动 物操作时, 这些实验室操作都可能产生传染性气溶胶。 肉眼 无法看到直径小于 5 μm的气溶胶以及直径为 5～ 100 μm的 小滴, 因此实验室工作人员通常意识不到有这样大小的颗粒 在生成, 并可能吸入或交叉污染工作台面上的其他材料。已 经表明正确使用生物安全柜可以有效减少由于暴露于气溶 胶所造成的实验室获得性感染以及培养物交叉污染。每一

种生物安全柜同时也可起到环境保护的作用(表 2) [ 10] 。 根据结构设计、排风比例及保护对象和程度的不同 ( 表 3) ,生物安全柜分为Ⅰ 、Ⅱ和Ⅲ级[ 11] 。 Ⅰ级生物安全柜仅保 护人员和环境,不保护样品; Ⅱ级生物安全柜不仅能提供人 员保护,而且能保护工作台面的物品以及环境不受其污染; Ⅱ级生物安全柜又可以分为 A型和 B型, A型包括Ⅱ级 A1 型和Ⅱ级 A2型; B型包括Ⅱ级 B 1型和Ⅱ级 B 2型。 Ⅲ级生 物安全柜是一种完全封闭的、彻底不泄漏的通风安全柜, 通 过连着的橡胶手套来进行安全柜内的操作。 在 BSL -3实验室中,一般选择Ⅱ级 B1型生物安全柜和 Ⅱ级 A2型生物安全柜, 通过管道将过滤后的空气排出, 不 在实验室内循环使用。在进行某些特殊试验时, 如感染动物 的解剖、病原微生物的气溶胶试验等,也可以安装Ⅱ级 B 2型 和Ⅲ级生物安全柜。

　除此之外, 还有用于个人安全防护的手套、外罩、长袍大 褂、鞋套、长筒靴、呼吸面具、口罩及防护眼镜等。这些个人 防护器材常与生物安全柜和其他工作用的容器组合使用。 在某些无法使用生物安全柜的情况下, 个人防护器材可能成 为在工作人员和传染性实验材料之间的主要防护屏障。 

2. 3　BSL -3实验室的防护性能的检测验证 BS L -3实验室在按照国标 《实验室生物安全通用要求》 GB 19489-2004和建设部的《生物安全实验室建筑技术规范》 GB 50346-2004建成后, 必须对其防护性能进行生物学检测验 证。生物学检测验证的范围包括 BS L -3实验室的排风高效 空气粒子过滤器、生物安全柜和高压灭菌器等。 目前, 高压灭菌器的检测验证国家已经有了相关的技术 标准, 可参照进行。生物安全柜的技术标准有望在年内颁布, 标准中对生物检测验证技术方法和要求作了明确规定。 BS L -3实验室的排风高效空气粒子过滤器的生物检测验证目 前还没有相关的技术标准, 但国家环境保护部门, 也正在着 手考虑制定相关的检测技术标准和规范。 对 BS L -3实验室设施和安全设备的生物学检测验证的 目的是, 保证 BS L -3实验室感染性固体废弃物、感染性液体 废弃物和感染性空气的排放,能够达到活病原微生物“零排 放”的要求。 

2. 4　实验室管理软件建设 BS L -3实验室均经特殊设计,从实验室建设到实验设施 及设备再到实验安全操作乃至最后的废弃物处理都有严格 的标准, 可以有效地防止微生物向环境中扩散。但是只要任 何环节出现问题,都会导致病原微生物外逸, 出现生物污染的风险性。生物实验室一旦发生安全事故, 其感染面积、影 响程度、传播速度、感染家禽等动物甚至人类数目都无法估 计, 后果是难以想像的。例如前苏联 1979年炭疽芽孢的泄 露事件 [ 12] 和新加坡、中国 台湾、北京生物实 验室发生的 SARS感染事故[ 13]就是非常典型的案例, 暴露了生物安全实 验室在安全防范设备方面的严重不足。 每一个生物安全实验室应当建立完善的管理体系, 详细 规定实验室的组织机构、实验室的管理规范直至实验操作规 程、人员的培训等。其目的是在保障正常的科研工作开展的 同时, 保障实验室内部及外部的环境安全。安全实验室的软 件建设应严格按照国家的有关规定执行, 在实际操作中应该 给予足够的重视。 目前对于生物实验室的风险预测尚无较好的预测模式, 我们应以应急处置方案的制定和实施 BSL -3实验室风险防 范为重点, 建立应急指挥体系, 各级人员应有明确的职责和 任务。建立应急处置系统, 一旦发生生物事件首先控制现 场, 并按照制定的紧急事故处理的方法对事故现场进行相应 的处理。一旦发生实验人员意外感染事件必须通报疫情,立 即关闭整个实验室, 隔离相关人员, 并按照《突发公共卫生事 件应急条例》等相关法律法规要求, 采取相应的控制措施。 如怀疑或确定有危险性生物逃逸出实验室范围时(如处理设 施发生事故) ,应及时上报有关部门, 采取观察、监测、通报等 相应的控制措施 [ 14] 。 

3　结语 

鉴于 BS L -3实验室的高风险性和特殊性, 其防范重点是 杜绝发生污染事故, 我们应在具体操作中严格执行实验室的 管理规范和操作规程, 做到建设前对项目进行安全评价, 实 验前进行实验项目的危险度评估并制订相关的事故防范及 应急处置措施, 实验中注重生物性污染物的无害排放, 加强 监控, 定期检查,有效地防止生物安全实验室对环境造成的 潜在影响。